Bedankt voor uw bezoek aan nature.com.U gebruikt een browserversie met beperkte ondersteuning voor CSS.Voor de beste ervaring raden we u aan een meer up-to-date browser te gebruiken (of de compatibiliteitsmodus in Internet Explorer uit te schakelen).Om voortdurende ondersteuning te garanderen, geven we de site in de tussentijd weer zonder stijlen en JavaScript.The ISME Journal volume 10, pagina's 533-545 (2016)Citeer dit artikelBacteriën spelen een centrale rol in de kringloop van koolstof, maar ons begrip van de relatie tussen de taxonomische samenstelling en de afbraak van opgeloste organische stof (DOM) is nog steeds slecht.In deze experimentele studie waren we in staat om een ​​direct verband aan te tonen tussen gemeenschapssamenstelling en het functioneren van ecosystemen doordat verschillend gestructureerde aquatische bacteriële gemeenschappen verschilden in hun degradatie van terrestrisch afgeleid DOM.Hoewel dezelfde hoeveelheid koolstof werd verwerkt, verschilden zowel het temporele patroon van afbraak als de afgebroken verbindingen tussen gemeenschappen.We ontdekten bovendien dat koolstof met een laag molecuulgewicht beschikbaar was voor alle gemeenschappen voor gebruik, terwijl het vermogen om koolstof met een hoger molecuulgewicht af te breken een eigenschap was die minder wijdverbreid was.Ten slotte, terwijl de afbraak van koolstof met een laag of een hoog molecuulgewicht niet beperkt was tot een enkele fylogenetische clade, illustreren onze resultaten dat bacteriële taxa met een vergelijkbare fylogenetische classificatie aanzienlijk verschilden in hun associatie met de afbraak van DOM-verbindingen.Door technieken toe te passen die de diversiteit en complexiteit van zowel bacteriële gemeenschappen als DOM vastleggen, biedt onze studie nieuw inzicht in hoe de structuur van bacteriële gemeenschappen processen van biogeochemische betekenis kan beïnvloeden.Carbon (C) cycling heeft de afgelopen jaren veel aandacht gekregen, aangespoord door de toename van kooldioxideconcentraties in de atmosfeer en de daarmee samenhangende klimaatveranderingen (Solomon et al., 2007).In het kielzog daarvan zijn pogingen ondernomen om het globale C-budget in evenwicht te brengen en een mechanisch begrip te ontwikkelen van de onderliggende dynamiek ervan.Dit heeft geleid tot een herziening van de traditionele opvatting waarin binnenwateren werden beschouwd als een passieve 'pijp' die C louter van land naar zee vervoerde.Nu wordt echter erkend dat binnenwateren een actief compartiment vormen: een compartiment dat C van terrestrische oorsprong mineraliseert, transformeert en opslaat, naast het transporteren naar de oceanen (Cole et al., 2007; Battin et al., 2009; Tranvik et al., 2009; Tranvik et al. al., 2009).Daarom en met het oog op toekomstige klimaatveranderingen, is het van groot belang om te begrijpen welke factoren de mineralisatie en transformatie van terrestrisch afgeleid C in zoetwaterecosystemen beïnvloeden.Het zijn de bacteriën die deze allochtone opgeloste organische stof (DOM) in wezen afbreken en in het aquatische voedselweb introduceren (Pomeroy 1974; Azam et al., 1983; Jansson et al., 2007).Bacteriële afbraak van DOM wordt uitgevoerd door fylogenetisch diverse gemeenschappen, waarvan is aangetoond dat de samenstelling wordt beïnvloed door de kwaliteit en kwantiteit van DOM (bijvoorbeeld Logue en Lindström, 2008).Bovendien wijzen verschillen in bacteriële bulkprocessen (bijvoorbeeld bacteriële ademhaling of productie) die verband houden met veranderingen in DOM-kwaliteit en -kwantiteit op het bestaan ​​​​van functioneel verschillende bacteriële groepen (bijvoorbeeld Kirchman et al., 2004).Toch hebben studies die onderzoeken hoe de samenstelling van bacteriële gemeenschappen de cycli van C in zoet water beïnvloedt, tot op heden niet-overtuigende resultaten opgeleverd;terwijl sommigen beweren dat ze een nauwe relatie hebben waargenomen tussen de samenstelling van de bacteriële gemeenschap (BCC) en de verwerking van C (Crump et al., 2003; Kirchman et al., 2004; Judd et al., 2006; Kritzberg et al., 2006; Langenheder et al. al., 2006; Bertilsson et al., 2007), anderen vonden inconsistente (Comte en del Giorgio, 2009, 2010; Lindström et al., 2010) of zwakke schakels (Langenheder et al., 2005).Er moet echter worden opgemerkt dat, in plaats van daadwerkelijk een directe relatie aan te tonen tussen BCC- en C-verwerking (zie Langenheder et al., 2005, 2006), de meeste onderzoeken illustreren dat omgevingsparameters, zoals DOM-kwaliteit en -kwantiteit, de samenstelling van de gemeenschap beïnvloeden en gelijk functioneren.Gezien de verwevenheid van BCC, het milieu en het functioneren van bacteriën, ontbreekt het duidelijk aan studies die de relatie tussen aquatische BCC en C-verwerking rechtstreeks aan de orde stellen.Dit gebrek kan deels te wijten zijn aan vroegere methodologische beperkingen.Ondanks hun belang in aquatische systemen, moeten DOM en microbiële diversiteit nog grotendeels worden gekarakteriseerd (Curtis en Sloan, 2005; Hertkorn et al., 2008).Aangezien DOM een van de meest complexe moleculaire mengsels op aarde is (Hedges et al., 2000) en microbiële gemeenschappen zeer divers zijn (Curtis en Sloan, 2004), gaan studies verder dan bulkbeoordelingen van DOM en de meest voorkomende leden van microbiële gemeenschappen waren nogal uitdagend.Recente technologische ontwikkelingen op het gebied van moleculaire biologie (bijvoorbeeld high-throughput sequencing) en de toepassing van geavanceerde instrumentele benaderingen in analytische chemie (bijvoorbeeld elektrospray-ionisatiemassaspectrometrie (ESI-MS)) hebben het echter mogelijk gemaakt om informatie te verkrijgen met meer resolutie en diepgang in dit opzicht (zie Kujawinski, 2011 voor een overzicht en Herlemann et al., 2014; Landa et al., 2014 en Shabarova et al., 2014 voor studies die de twee benaderingen combineren).Een dergelijke diepgaande en integratieve karakterisering van zowel complexe DOM-verbindingen als microbiële gemeenschappen is een voorwaarde voor het onderzoeken van de relatie tussen de samenstelling van de microbiële gemeenschap en de verwerking van DOM.Hier hebben we het verband bestudeerd tussen de samenstelling van aquatische bacteriële gemeenschappen en de afbraak van DOM van terrestrische oorsprong.Het doel was om te onderzoeken hoe bacteriële gemeenschappen die in samenstelling verschillen, verschillen in hun verwerking van DOM.We veronderstelden dat bacteriële assemblages van verschillende oorsprong verschillen in hun vermogen en potentieel om DOM af te breken, omdat ze in samenstelling variëren.We hebben deze hypothese getest door een gemeenschappelijk tuinexperiment aan te nemen waarin een uniform, terrestrisch afgeleid maar kunstmatig bereid DOM-medium werd ingeënt met aquatische bacteriële gemeenschappen verzameld op vier locaties met verschillende milieukenmerken.De vier milieulocaties die voor dit experiment zijn geselecteerd, bevinden zich allemaal in het stroomgebied van de Umeå in de boreale zone van Noord-Zweden en verschilden in kenmerken van opgeloste organische koolstof (DOC) (aanvullende tabel S1).Er werden twee watermonsters genomen in het stroomgebied van Krycklan op de locatie voor ecologisch langetermijnonderzoek van Svartberget (Laudon et al., 2013): dat wil zeggen, een humus bovenloopmeer (EnvHL) en een grondwatermonster (EnvGW).De twee resterende watermonsters werden stroomafwaarts van het stroomgebied van Krycklan verzameld in de Vindelälven-rivier (EnvVA), een van de twee belangrijkste zijrivieren van de Umeå-rivier, en de monding in de Oostzee (EnvBa).De bemonstering werd uitgevoerd op 29 mei 2012, tegen het einde van de voorjaarsvloed.Op elke locatie werden twee monsters genomen: één voor bacteriële abundantie en samenstelling van de gemeenschap en één voor waterchemische analyses.Monsters voor bacteriële abundantie en gemeenschapssamenstelling werden verzameld in steriele polypropyleenflessen van 1 liter (Nalgene, Rochester, MN, VS), terwijl waterchemiemonsters werden verzameld in zuurgewassen (pa-kwaliteit HCl; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) en Milli-Q (ion- en nuclease-vrij water) gespoelde polyethyleen flessen (Mellerud Plast, Mellerud, Zweden).EnvBa, EnvHL en EnvVA werden bemonsterd door middel van steekmonsters, terwijl EnvGW werd bemonsterd uit een ondiepe, geperforeerde grondwaterput.Monsters werden tijdens het transport naar het laboratorium koud en in het donker bewaard.In het laboratorium werden waterchemiemonsters bewaard bij -20 ° C tot verdere verwerking, terwijl monsters voor bacteriële overvloed en gemeenschapssamenstelling eerst werden voorgezeefd (225 m; nylon netfilter) en gefilterd met een GF / F-filter (0,7 m , voorverbrand bij 400 ° C gedurende 6 uur; Whatman, Maidstone, VK) om te voorkomen dat grotere deeltjes worden opgevangen en respectievelijk grazers worden verwijderd.Het experiment werd uitgevoerd als een algemeen tuinexperiment, waarbij een batchcultuurbenadering werd toegepast waarbij een medium dat kunstmatig was afgeleid van grond werd geïnoculeerd met bacteriële cellen uit de vier omgevingen (hierna experimentele behandelingen genoemd: Ba, GW, HL en VA).Een controle, bestaande uit alleen medium (dat wil zeggen, geen bacterieel inoculum toegevoegd), werd naast de vier experimentele behandelingen uitgevoerd.Batchculturen werden bereid in glazen flessen van 1 liter met een afdichting die als volgt is geconstrueerd: een polybutyleentereftalaatschroefdop met opening, die een siliconenrubberen afdichting vasthoudt die is doorboord met twee gaten;een voor een metalen naald die is aangesloten op een steriele injectiespuit van 60 ml om het afnemen van monstermateriaal mogelijk te maken, de andere voor een steriel ontluchtingsfilter om het ontstaan ​​van een vacuüm bij het afnemen van monstermateriaal te voorkomen.Batchculturen werden zonder kopruimte gevuld en gedurende het experiment continu geroerd.Het roeren werd uitgevoerd met behulp van magnetische roerstaven in combinatie met magnetische roerders.Magnetische roerstaven werden met zuur gewassen (pa-kwaliteit HCl; Sigma-Aldrich), gespoeld met Milli-Q en met hitte gesteriliseerd bij 120 ° C vóór gebruik in batchculturen.Het medium werd bereid uit grond verzameld uit de bovengrond in de oeverzone 50 m stroomafwaarts van de grondwaterbemonsteringslocatie.De grond werd tijdens het transport naar het laboratorium koud en in het donker bewaard, waar het tot verdere verwerking bij -20 °C werd bewaard.In het laboratorium werd ~200 g aarde toegevoegd aan 0,8 l Milli-Q en 3 uur in het donker op een draaitafel geschud.Het grond-watermengsel werd vervolgens onderworpen aan een stapsgewijze filtratie, uitgaande van filters met een poriegrootte van 225 tot 0,2 m.Grove filters (225, 150, 75 en 50 m; nylon netfilters) werden met zuur gewassen (pa-kwaliteit HCl; Sigma-Aldrich), gespoeld met Milli-Q en met hitte gesteriliseerd bij 120 ° C, terwijl filters met kleinere poriën grootte werden ofwel 6 uur bij 400 °C (20 en 8 m; cellulosefilters asloze kwaliteiten; Whatman) verbrand of bij 120 °C (0,7 en 0,2 m; Supor PES-membraanschijffilters; Pall Corporation, Port Washington, WI, VS) vóór gebruik.In een laatste stap werd tangentiële stroomfiltratie (50 kDa; Pellicon XL-filter; Merck Millipore, Billerica, MA, VS) uitgevoerd om een ​​steriel medium met betrekking tot bacteriën te verkrijgen.Nadat het medium was verdund tot een eindconcentratie van 17 mg C l−1, werden stikstof en fosfor toegevoegd als NH4-NO3 (eindconcentratie: 3,26 mg N l−1) en NaH2-PO4 (eindconcentratie: 0,97 mg P l− 1), waardoor stikstof- en fosforbeperking worden voorkomen.Er werden vier inocula bereid;elk één uit het respectievelijke GF/F-filtraat van de vier milieusites.Na 6 dagen bij 4 °C en in het donker te zijn bewaard (dat wil zeggen, van het nemen van monsters in het veld tot het bereiden van de inocula in het laboratorium), werden de inocula geconcentreerd tot ~1 × 106 cellen ml-1 via tangentiële stroomfiltratie (Merck Millipore) en vervolgens toegevoegd aan het medium (1% van het eindvolume; behalve aan de controles).Ten slotte werden op tijdstip nul (dat wil zeggen, het begin van het experiment), elk van de vier experimentele behandelingen en de controle (5 × 1, n = 5) verdeeld in respectievelijk drie batchculturen: dat wil zeggen behandelingen en controle werden elk uitgevoerd in drie onafhankelijke triplo's (5 x 3, n = 15) na tijdstip nul (zie aanvullende methoden S1 voor een gedetailleerde beschrijving van de bereiding van inocula, inoculatie en start van het experiment).Het experiment is uitgevoerd in een kamer met constante temperatuur bij 15 °C en in het donker en na 5,5 dag beëindigd op basis van afvlakking van de DOC-concentraties.Er werden monsters genomen voor bulk-DOC-concentratie, UV-zichtbare absorptie en fluorescentie, ESI-MS, bacteriële abundantie en BCC.Bulk DOC-concentratie en UV-zichtbare absorptie en fluorescentie werden bemonsterd op zeven (dat wil zeggen 0, 30, 78, 90, 102, 114 en 126 uur), terwijl monsters voor bacteriële abundantie negen keer tijdens het experiment werden genomen (dat is, 0, 10, 30, 54, 78, 90, 102, 114 en 126 uur).ESI-MS-monsters werden zowel aan het begin als aan het einde genomen, terwijl BCC pas aan het einde van het experiment werd bemonsterd.Monsters voor BCC werden bovendien ook genomen uit de vier oorspronkelijke omgevingen (uit het respectievelijke GF/F-filtraat; aanvullende methoden S1 en aanvullende figuur S1).Alle glas- en kunststofwaren werden een nacht met zuur gewassen in HCl (pa-kwaliteit; Sigma-Aldrich), uitgebreid gespoeld met Milli-Q en 6 uur bij 400 ° C verbrand of respectievelijk met hitte gesteriliseerd (120 ° C).Monsters geanalyseerd op DOC en optische eigenschappen werden voorgefilterd met een 0,2 μm spuitfilter (Puradisc PES; Whatman).De concentratie van DOC werd geregistreerd met behulp van een Sievers 900 Laboratory Total Organic Carbon Analyzer (UV / persulfaatoxidatie; GE Analytical Instruments, Manchester, VK).De bereidingswijze van het medium zorgde voor verwaarloosbare concentraties aan fijnverdeeld organisch materiaal;daarom is totaal organisch C vergelijkbaar met DOC.Absorptiespectra werden gemeten van 200 tot 700 nm met intervallen van 1 nm, met een Lambda 35 UV-zichtbare spectrometer (Perkin Elmer, Waltham, MA, VS).Monsters werden gemeten in een kwartscuvet van 1 cm en gedestilleerd water werd als blanco meting gebruikt.Excitatie-emissiematrices (EEM's) werden verzameld met een FluoroMax-2-spectrofluorometer (Horiba Scientific, Edison, NJ, VS), met behulp van een kwartscuvet van 1 cm.Excitatiegolflengten (λEx) liepen van 250 tot 445 nm in stappen van 5 nm, terwijl emissiegolflengten (λEm) varieerden van 300 tot 600 nm in stappen van 4 nm.Excitatie- en emissiespleetbreedtes waren ingesteld op 5 nm en de integratietijd was 0,1 s.Blanco aftrekken, correctie van EEM's en kalibratie naar Raman-eenheden werd uitgevoerd volgens Murphy et al.(2010).Vier individuele fluorescerende componenten in de EEM's werden geïdentificeerd en gevalideerd met parallelle factor (PARAFAC) analyse, met behulp van de MATLAB en Statistics Toolbox (R2013a; The MathWorks, Inc., Natick, MA, VS) in combinatie met de DOMFluor toolbox (Stedmon en Bro , 2008).De componenten zijn afgeleid van de EEM's van 95 monsters en hun fluorescentiekenmerken worden weergegeven als inzetstukken in figuur 3b.DOM werd eerst geïsoleerd via vastefase-extractie (SPE) zoals beschreven door Dittmar et al.(2008).Merk op dat SPE - zoals elke momenteel beschikbare DOM-isolatiemethode - slechts een bepaald deel van de totale DOM behoudt (dat wil zeggen, polaire verbindingen met een laag tot matig molecuulgewicht), maar de extractie-efficiëntie is over het algemeen hoger in vergelijking met andere isolatiemethoden (Green et al. ., 2014).In het kort werden experimentele monsters gefilterd (0,2 m; Puradisc PES-spuitfilter; Whatman), aangezuurd met HCl (pa-kwaliteit; Sigma-Aldrich) tot pH 2, 5 en bewaard bij 4 ° C tot SPE.SPE-cartridges (Bond Elut-PPL, 1 g, 6 ml; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, VS) werden een nacht geweekt in methanol (LC-MS CHROMASOLV; Sigma-Aldrich), gespoeld in Milli-Q, opnieuw gespoeld met methanol, en daarna gespoeld met aangezuurde Milli-Q (pH=2, pa kwaliteit HCl; Sigma-Aldrich).Onmiddellijk voor SPE werden monsters nog een keer aangezuurd met HCl (pa-kwaliteit; Sigma-Aldrich) tot pH 2. Aangezuurde monsterhoeveelheden (600 ml) mochten door de zwaartekracht door de SPE-patronen gaan.Patronen werden vervolgens gespoeld met aangezuurde Milli-Q (pH = 2, pa-kwaliteit HCl; Sigma-Aldrich) en gedroogd met gasvormig N2.DOC werd geëlueerd met 4 ml methanol en bewaard bij -20°C.Massaspectra werden verzameld op een quadrupool time-of-flight massaspectrometer, werkend in scanmodus met negatieve ESI.Blanco injecties van de mobiele fase en twee geselecteerde monsters (hierna referentiemonsters genoemd) werden elk vier keer gemeten, waarbij de laatste keer werd gecontroleerd op instrumentafwijking, reproduceerbaarheid van de metingen en analytische precisie.Een meer gedetailleerde beschrijving is te vinden in Aanvullende methoden S2.Gegevensreductie van massaspectra werd als volgt uitgevoerd: massa-tot-ladingverhoudingen (m/z) werden weggegooid naar gehele getallen, wat resulteerde in 1900 m/z variërend van 100 tot 1999 (zie figuur 5a voor een voorbeeld).Vervolgens werden representatieve monstermassaspectra verkregen door spectra over het injectieprofiel te combineren.Een gemiddelde blanco meting werd berekend en afgetrokken van alle monsters.De vier afzonderlijke metingen van elk van de twee geselecteerde referentiemonsters werden daarna gebruikt om de analytische precisie te schatten en te testen.Eerst werd de sd voor elke m/z voor beide referentiemonsters berekend.Vervolgens werd de hoogste sd van een van de twee geselecteerd bij elke m/z en vermenigvuldigd met 2. Ten slotte werd deze gerecombineerde spectra aangenomen om een ​​drempel te definiëren voor het aangeven van significante veranderingen in DOM-massaspectra tijdens het experiment;alleen veranderingen >2 sd voor elke respectieve m/z werden als significant beschouwd en opgenomen in volgende analyses.Bacteriële cellen werden bewaard in steriel gefilterd, met borax gebufferd formaldehyde in een eindconcentratie van 4% w/v.Bacteriële overvloed werd geteld door flowcytometrische bepaling (CyFlow-ruimte; Partec, Münster, Duitsland) van SYTO 13- (Invitrogen, Carlsbad, CA, VS) gekleurde cellen, volgens de methode beschreven door del Giorgio et al.(1996).Bacterioplanktoncellen werden verzameld op 0,2 m membraanfilters (Supor-200 Membrane Disc Filters; Pall Corporation), waarbij 0,2 l water werd gefiltreerd.Filters werden in steriele cryogene flesjes (Nalgene) geplaatst en uiteindelijk bij -80 ° C bewaard tot verdere verwerking.Nucleïnezuurextractie werd uitgevoerd volgens protocol 3 van de Easy-DNA-kit (Invitrogen) met een extra 0,2 g 0,1 mm zirkoniumoxide/silicakorrels.Geëxtraheerde nucleïnezuren werden op maat gemaakt en opbrengsten gekwantificeerd door middel van agarose (1%) gelelektroforese, GelRed-kleuring (Biotium Inc., Hayward, CA, VS) en UV-transilluminatie vóór PCR-amplificatie.De bacteriële hypervariabele regio's V3 en V4 van het 16S-rRNA-gen werden PCR-geamplificeerd met behulp van respectievelijk bacteriële forward en reverse primer 341 (5'-IndexTerm CCTACGGGNGGCWGCAG-3′) en 805 (5'-IndexTerm GAC TACHVGGGTATCTAATCC-3′) ( Herlemann et al., 2011).De primers werden vóór gebruik gemodificeerd volgens de uiteindelijke configuratie: AdaptorB-341F en AdaptorA-MID-805R (AdaptorA en B zijn 454 Life Sciences-adaptersequenties; 454 Life Sciences, Branford, CT, VS).Multiplex-ID's waren zeven nucleotiden lang, monsterspecifiek en ontwikkeld volgens aanbevelingen van Engelbrektson et al.(2010).PCR-reacties werden uitgevoerd in een reactievolume van 20 l bestaande uit 0,4 U Phusion high-fidelity DNA-polymerase (Finnzymes, Espoo, Finland), 1 x Phusion HF-reactiebuffer (Finnzymes), 200 μM van elk dNTP (Invitrogen), 200 nM van elke primer (Eurofins MWG, Ebersberg, Duitsland), 0,1 mg ml-1 T4-gen 32-eiwit (New England Biolabs, Ipswich, VK) en tenslotte 5-10 ng geëxtraheerd nucleïnezuur.Thermocycling (DNA Engine (PTC-200) Peltier Thermal Cycler; Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, VS) werd uitgevoerd met een initiële denaturatiestap bij 95 ° C gedurende 5 minuten, gevolgd door 27 denaturatiecycli bij 95 ° C voor 40 s, gloeien bij 53 ° C gedurende 40 s, verlenging bij 72 ° C gedurende 1 minuut en afgerond met een verlengingsstap van 7 minuten bij 72 ° C.Per monster werden vier technische replica's uitgevoerd, samengevoegd na PCR-amplificatie en gezuiverd met behulp van de Agencourt AMPure XP-zuiveringskit (Beckman Coulter Inc., Brea, CA, VS).Nucleïnezuuropbrengsten werden gecontroleerd op een fluorescentie-microplaatlezer (Ultra 384; Tecan Group Ltd, Männedorf, Zwitserland), waarbij gebruik werd gemaakt van de Quant-iT PicoGreen dsDNA-kwantificatiekit (Invitrogen).Ten slotte werden PCR-amplicons in equimolaire verhoudingen samengevoegd om een ​​vergelijkbaar aantal 454-pyrosequencing-uitlezingen per monster te verkrijgen.Van het uiteindelijke gepoolde amplicon werd unidirectioneel de sequentie bepaald (Lib-L-chemie) op een 454 GS-FLX-systeem (454 Life Sciences) in het Norwegian High-Throughput Sequencing Center (NSC, Oslo, Noorwegen; http://www.sequencing.uio. nr), met behulp van GS-FLX Titanium-reagentia.De 454-pyrosequencing-fouten, PCR-single-base-fouten en chimere sequenties werden verwijderd uit de 454-pyrosequencing-ampliconbibliotheek met AmpliconNoise (v1.26; Quince et al., 2011) gevolgd door Perseus (Quince et al., 2011).Pyrosequencing-uitlezingen die niet overeenkwamen met multiplex-identificatie- en/of primersequenties werden verwijderd, net zoals uitlezingen korter dan 200 bp.De uitlezingen werden verder afgekapt op 450 bp, waardoor extra ruis werd geëlimineerd (Mardis, 2008), en uiteindelijk werden de multiplex-identificatie- en primersequenties verwijderd.Denoised 454-pyrosequenties werden geclusterd in operationele taxonomische eenheden (OTU's) op een niveau van 97% sequentie-identiteit (AmpliconNoise, v1.29; Quince et al., 2011) en geclassificeerd op basis van de RDP-naïeve Bayesiaanse rRNA Classifier (RDP Classifier, v2 .6; Wang et al., 2007).Representatieve sequenties werden uitgelijnd op basis van de SILVA-uitlijning (release 102; Quast et al., 2013) met behulp van mothur (v1.33.2; Schloss et al., 2009).Ten slotte werden pyrosequenties die niet konden worden uitgelijnd of toegewezen, of die waren toegewezen als Archaea of ​​Eukaryota (bijvoorbeeld chloroplasten), verder verwijderd.De 454-pyrosequencing-lezingen van zowel experimentele (Ba, GW, HL en VA) als omgevingsmonsters (EnvBa, EnvGW, EnvHL en EnvVA) zijn gedeponeerd bij het NCBI Sequence Read Archive onder toegangsnummer SRP021096.Pyrosequencing-bemonsteringsinspanningen (dat wil zeggen, het aantal pyrosequences dat per monster wordt verkregen) werden genormaliseerd voor statistische gegevensanalyse.Normalisatie werd gedaan over monsters door middel van sub-sampling en analyses zijn gebaseerd op 29 206 metingen die willekeurig uit elk experimenteel monster zijn getrokken.Om verschillen in BCC tussen experimentele behandelingen te analyseren, werd een multivariaat gegeneraliseerd lineair model (Wang et al., 2012; Warton et al., 2012) toegepast.Het model dat is gefit is log-lineair en gaat uit van een negatieve binominale verdeling van gegevens.Relaties tussen bacteriële assemblages aan het einde van het experiment werden gevisualiseerd met behulp van niet-metrische multidimensionale schaalindeling (Bray-Curtis-afstand).Om te onderzoeken of bacteriële abundanties of DOC-concentraties significant verschilden tussen behandelingen aan het einde van het experiment, werd een eenrichtingsvariantieanalyse (ANOVA) uitgevoerd.ANOVA's met herhaalde metingen werden uitgevoerd voor bacteriële abundanties, DOC-concentraties en fluorescentie-intensiteiten van PARAFAC-componenten tussen experimentele behandelingen, om te testen op behandelings- en tijdeffecten en op een interactie van de twee gedurende het experiment.Permutationele ANOVA's (Euclidische afstand) werden berekend om verschillen tussen de experimentele behandelingen te onderzoeken met betrekking tot fluorescentie, fluorescerende (PARAFAC) componenten en m/z aan het einde van het experiment.De relaties tussen experimentele behandelingen met betrekking tot m/z werden bovendien geanalyseerd door middel van principale componentenanalyse.Ten slotte werden associaties tussen bacteriële OTU's en verandering in m/z onderzocht via de test- en correlatieanalyse van Mantel.Mantel's testen werden uitgevoerd tussen afstandsmatrices afgeleid van de uiteindelijke relatieve abundanties van bacteriële OTU's (Bray-Curtis-afstand) en verandering in m / z van het begin tot het einde van het experiment (Euclidische afstand).Correlatieanalyse getest op co-variatie tussen de uiteindelijke relatieve abundantie van de meest voorkomende bacteriële taxa en verandering in m/z.De meest voorkomende taxa werden willekeurig gedefinieerd als OTU's met> 100 metingen per OTU voor alle experimentele monsters (35 in totaal).Om te corrigeren voor meerdere correlaties, werden P-waarden aangepast aan de valse ontdekkingssnelheid (Benjamini en Hochberg, 1995).Alle statistische gegevensanalyses zijn uitgevoerd met R (2015), met name de veganistische (Oksanen et al., 2008) en de mvabund (Wang et al., 2012) pakketten, en P-waarden waren tegengesteld aan een α-waarde van 0,05 .Milieu- en experimentele monsters bevatten respectievelijk gemiddeld 1259 en 64 OTU's (aanvullende tabel S2 en aanvullende figuur S2).Bacteriële gemeenschappen van de vier milieusites waren qua samenstelling van elkaar te onderscheiden (aanvullende figuur S3).De drievoudige experimentele bacteriële assemblages leken qua samenstelling meer op elkaar dan op die van andere experimentele behandelingen, zoals zowel niet-metrische multidimensionale schaalverdeling (Figuur 1) als multivariate gegeneraliseerd lineair model (Wald=35.88, P=1.00E−03) laten zien .NMDS-weergave van bacteriële gemeenschappen van de vier experimentele behandelingen.NMDS-inwijding werd afgeleid van paarsgewijze Bray-Curtis-afstanden.Getallen verbeelden replica's één, twee en drie.Hulls werden getrokken om replica's te groeperen binnen een experimentele behandeling.Afkortingen: Ba, Baltisch;GW, grondwater;HL, bovenloopmeer;VA, Vindelälven.Bacteriële abundanties van de vier behandelingen namen in de loop van het experiment aanzienlijk toe van gemiddeld 1,6 × 104 in het begin tot tussen 4,1 × 107 en 1,8 × 108 cellen ml-1 aan het einde (Figuur 2a).Overvloeden die in de controles werden geregistreerd, lagen gedurende het hele experiment op of marginaal boven de detectielimiet.Over het algemeen veranderden de bacteriële abundanties in de loop van de tijd aanzienlijk en anders wat betreft behandelingen in de loop van het experiment (tabel 1).Toch verschilde alleen HL significant van de andere behandelingen in termen van bacteriële overvloed aan het einde van het experiment (ANOVA; F=21.67, P=3.39E−04; Figuur 2a).De groeicurven lijken min of meer op de groei van een batchcultuur van een enkele soort (met een aanvankelijke vertraging, een exponentiële en het begin van een stationaire fase).Trends van bacteriële abundanties (a) en DOC-concentraties (b).Bacteriële abundanties en DOC-concentraties werden gemeten in de loop van het experiment voor de vier behandelingen en de controle (gemiddelde ± se, n = 3 replica's; behalve voor tijdstip 0, waar n = 1).Letters A en B in a duiden op significante verschillen tussen behandelingen met betrekking tot bacteriële abundanties aan het einde van het experiment (A) of niet (B), respectievelijk beoordeeld door middel van Tukey's post-hoc-test op een ANOVA.Afkortingen: Ba, Baltisch;C, controle;GW, grondwater;HL, bovenloopmeer;VA, Vindelälven.De concentratie DOC in alle behandelingen nam in de loop van het experiment met ongeveer tweederde af van gemiddeld 17 mg C l-1 in het begin tot 6 mg C l-1 aan het einde (Figuur 2b).Ook de controlemonsters kenden een daling, zij het aanzienlijk minder uitgesproken.Over het algemeen veranderden de DOC-concentraties in de loop van de tijd aanzienlijk, hoewel alleen VA in de loop van het experiment significant verschilde van de andere drie behandelingen (tabel 1).DOC-concentraties gemeten aan het einde van het experiment verschilden niet tussen de vier behandelingen (ANOVA; F=0,85, P=0,51).De veranderingen in fluorescentie in de controles waren minimaal in vergelijking met de vier experimentele behandelingen (Figuur 3a).Ba, GW en HL vertoonden een hoge mate van overeenkomst in kwalitatieve (spectrale) verandering met een duidelijke verwijdering van fluorescentie bij ~λEm 460 en 300 nm.VA, aan de andere kant, vertoonde een opmerkelijk verschil met de andere experimentele behandelingen doordat een verlies van fluorescentie bij ~λEm 360 nm en een toename in fluorescentie bij ~λEm 470 nm kon worden waargenomen (Figuur 3a).Verder verschilden de vier behandelingen significant van elkaar met betrekking tot fluorescentie aan het einde van het experiment (permutationele ANOVA; R2=0.83, P=2.00E−03).PARAFAC-analyse identificeerde vier verschillende fluorescerende componenten waarvan de moleculaire structuren onbekend zijn.Componenten één en twee (C1 en C2) vertoonden locaties met maximale piekintensiteiten die typisch zijn voor wat wordt aangeduid als humusachtig, terwijl component 3 (C3) fluorescentie-eigenschappen vertoonde die vergelijkbaar waren met die van het aminozuur tryptofaan (ook wel eiwitachtig genoemd).Component 4 (C4) toonde tussenliggende kenmerken.De controles vertoonden in het algemeen geen verandering in fluorescentie-intensiteiten voor alle vier de componenten (Figuur 3b).Vergeleken met de andere twee componenten, bleven C1 en C2 min of meer ongewijzigd in fluorescentie gedurende het experiment, met slechts een lichte systematische verwijdering van C1 in alle behandelingen behalve VA.C3 vertoonde een substantiële afname in intensiteit, terwijl C4 een marginale toename ervoer voor alle vier experimentele gemeenschappen (Figuur 3b).PARAFAC-componenten veranderden overwegend significant in de loop van de tijd, maar alleen C3 verschilde significant tijdens het experiment voor alle behandelingen (tabel 1).Permutationele ANOVA identificeerde bovendien significante verschillen in PARAFAC-componenten tussen de vier behandelingen aan het einde van het experiment (R2=0.97, P=9.99E−04).Netto veranderingen in DOM-fluorescentie (a) en fluorescentie-intensiteiten van componenten geïdentificeerd door PARAFAC-analyse (b).(a) Excitatie-emissiematrices (EEM's) aan het begin van het experiment (n = 1) samen met de gemiddelde verandering en sd in fluorescentie van het begin tot het einde van het experiment over de drie replica's voor elke behandeling (n = 3 ).Excitatie (λEx) en emissie (λEm) golflengten worden respectievelijk op de x- en y-as gegeven.(b) Veranderingen in de fluorescentie-intensiteiten van PARAFAC-componenten: C1, C2, C3 en C4 (gemiddelde ± se, n = 3; behalve voor tijdstip 0 en tijdstip 2 alleen voor VA, waarbij n = 1).Alle componenten werden genormaliseerd naar nul voor tijdstip nul, behalve die in VA, die werden genormaliseerd naar nul voor het tweede tijdstip, omdat de meting op tijdstip nul moest worden weggegooid vanwege een foutieve aflezing.Insets visualiseren de respectieve spectrale eigenschappen van de vier fluorescerende componenten die zijn geïdentificeerd door PARAFAC-analyse.Afkortingen: Ba, Baltisch;C, controle;GW, grondwater;HL, bovenloopmeer;VA, Vindelälven.Massaspectra (zie figuur 5a voor een voorbeeld) van de vier behandelingen verschilden in het begin van het experiment niet noemenswaardig van elkaar (figuur 4);aan het einde deden ze dat echter wel (zoals te zien is in figuur 4 en bevestigd door permutatie-ANOVA; R2=0.42, P=1.70E−03).Sommige massa's namen ook aanzienlijk af in intensiteit in de controles (Figuur 5b).Bacteriële assemblages van Ba ​​en HL verminderden de intensiteit van massa's van een zeer breed bereik van m/z, terwijl bacteriën van GW en VA de neiging hadden om de intensiteit van massa's van <600 mz bij voorkeur te verminderen (figuur 5b).verder is het alleen binnen een zeer smal massabereik (~ 200-600>